小量細(xì)菌克隆的雜交法篩選實(shí)驗(yàn)步驟方法

小量細(xì)菌克隆的雜交法篩選實(shí)驗(yàn)步驟方法:

1. 將硝酸纖維膜或尼龍膜鋪于含有選擇性抗菌素的瓊脂板（實(shí)驗(yàn)平板）上。

由于手指上的油會(huì)影響濾膜浸濕并妨礙 DNA 轉(zhuǎn)移，操作濾膜時(shí)應(yīng)帶上手套。

2. 在一張繪圖紙上畫(huà)出數(shù)字標(biāo)記的方格（方格大小 1 cm2 )，在每一塊瓊脂主板的底部標(biāo)記數(shù)字，并把瓊脂板放在方格紙上，在瓊脂板邊緣的 6 點(diǎn)鐘位置上作好標(biāo)記。

這樣標(biāo)記將使主板于方格的方向一致。

3. 用無(wú)菌牙簽或接種環(huán)將菌落逐一地轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)板的濾膜上和含有選擇性抗菌素的主板上（沒(méi)有濾膜）。按照板下方的方格將菌落劃成 2~3 mm 的短線或點(diǎn)，每一菌落在兩塊板中的位置相同。

一塊 90 mm 板可劃 100 個(gè)克隆。

4. zui后在濾膜和主瓊脂板上各劃一個(gè)含非重組質(zhì)粒（如 pUC) 的克隆。

陰性對(duì)照對(duì)于用放射性探針區(qū)別空質(zhì)粒和重組質(zhì)粒是必要。從重組質(zhì)粒的限制酶切產(chǎn)物和瓊脂糖電泳中提取的 DNA 片段常被質(zhì)粒 DNA 序列污染，當(dāng)污染的 DNA 片段用作雜交探針進(jìn)行轉(zhuǎn)化克隆的 Grunstein-Hogness 篩選時(shí)，就會(huì)造成麻煩。

5. 倒置瓊脂板置于 37℃ 培養(yǎng)直至菌線的寬度校至 0.5~1.0 mm ( 通常需 6~16 h）。

這一階段，如細(xì)菌生長(zhǎng)仍然很快，濾膜應(yīng)轉(zhuǎn)至含有*的瓊脂板，再于 37℃ 進(jìn)一步培養(yǎng) 12 h（Hanahan and Meselson 1980，1983)。這個(gè)擴(kuò)增的過(guò)程只有在重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)預(yù)計(jì)很低的情況下（如插入的是較大的外源 DNA 片段 )，或當(dāng)簡(jiǎn)并度較高的寡核苷酸用作探針時(shí)，是必要的?？寺〉?DNA 片段通常很容易通過(guò)雜交被檢出，不需要預(yù)*行重組質(zhì)粒的擴(kuò)增。擴(kuò)增只對(duì)那些以松散方式復(fù)制的質(zhì)粒是有效的。

6. 在三個(gè)或更多不對(duì)稱(chēng)的位置上標(biāo)記濾膜，用連在裝有防水墨汁注射器上的 18 號(hào)針頭將濾膜刺穿直至實(shí)驗(yàn)板的瓊脂中。在主板相近的位置上也作同樣標(biāo)記。

實(shí)踐中，用空的 18 號(hào)針頭在濾膜和下層瓊脂間穿孔而避免使用墨水（墨水會(huì)弄得很臟），是可能的，雜交 后，通過(guò)來(lái)自光盒的背光可以對(duì)濾旗上的孔與瓊脂上的痕跡進(jìn)行校對(duì)。

很多研究者更喜歡用剪刀在濾膜四周不同位置上剪出缺口的方法來(lái)確定方向。將剪出缺口并作好標(biāo)記的濾膜置于瓊脂表面，而后在培養(yǎng)板背面標(biāo)記出濾膜鋸齒狀邊緣的位置。這樣通過(guò)鋸齒的形狀和位置就可確定在培養(yǎng)板上的方向。

7. 用 Parafilm 膜將主板封好，顛倒后于 4℃ 保存，直至得出雜交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

8. 裂解附著于濾膜上細(xì)菌，將釋放出的 DNA 結(jié)合到硝酸纖維素膜或尼龍膜上。進(jìn)行雜交。小量細(xì)菌克隆的雜交法篩選實(shí)驗(yàn)步驟，